La microscopie des sédiments urinaires est un travail difficile. Celui-ci devient rapidement inconfortable même pénible avec un instrument mal réglé ou en mauvais état. Travailler des heures dans des conditions inconfortables, comme s’arracher les yeux assis sur un banc de tôle avec les genoux qui frottent sur une armoire, peut avoir une influence sur la qualité des résultats. Une station de travail confortable avec un instrument de qualité est, selon nous, une nécessité pas un luxe.

Dans cette section nous discuterons de certains éléments du microscope ainsi que de leur ajustement. Les principes optiques de la formation des images ne sont pas discutés, nous suggérons au lecteur de consulter la littérature spécifique sur le sujet. Comme ce texte s’adresse à des personnes qui connaissent le microscope notre discussion porte surtout sur des particularités qui sont peut-être oubliées.

Les éléments du microscope

Principales parties du microscope

Le microscope est un instrument optique composé de plusieurs éléments. Le nom de ces éléments est donné à la figure. Le grossissement total du microscope est le produit du grossissement de l’objectif multiplié par le grossissement de l’oculaire. Ainsi, un objectif 40x avec un oculaire 10x fournit un grossissement total de 400.

Les oculaires

Il y a plusieurs types d’oculaires qui se distinguent par le degré de correction chromatique, le grossissement et la distance pupillaire. L’oculaire le plus courant est le 10x de type C. Ce type d’oculaire est utilisé avec les objectifs achromatiques. Les oculaires sont aussi disponibles avec un grossissement de 8x à 12,5x. Certains oculaires sont construits pour permettre l’examen avec des verres correcteurs. La distance pupillaire, c’est-à-dire la distance à tenir entre la lentille de l’oculaire et la pupille, est plus grande. Ces oculaires sont désagréables pour celui qui ne porte pas de verre correcteur car, la position correcte est difficile à repérer. Une solution à ce problème est d’installer des bonnettes qui permettent de s’ajuster facilement à la bonne distance de la lentille et de couper la lumière ambiante.

Une autre caractéristique des oculaires est le coefficient de champ. Ce coefficient détermine le diamètre du champ observé. Ainsi, un objectif 10x et un oculaire avec un coefficient de champ de 16 donne un champ de 1,6 mm de diamètre (1600 m ) ce qui représente une surface d’environ 2 mm2. Le diamètre du champ se calcule en divisant le coefficient de champ par le grossissement de l’objectif. Si un étalement est de 20 ul avec une lamelle de 22x22 mm on arrive, en ignorant le volume qui excède les bords de la lamelle, à un volume d’environ 80 nl /champ au 10x avec un coefficient d’oculaire de 16.

Les objectifs

Pour le sédiment urinaire, les objectifs les plus utiles sont le 10x et le 40x. Il existe un objectif intermédiaire très efficace: le 25x. Peu de laboratoires utilisent cet objectif principalement à cause des résultats qui sont rapportés au 100x pour les cylindres et au 400x pour les cellules.

La majorité des microscopes viennent équipés d’un 4x et d’un 100x. Sauf pour des utilisations spécifiques comme la recherche d’éosinophiles le 100x est peu utilisé. Le 100x travaille en immersion ce qui limite son utilité. Il est cependant possible de lire un état frais entre lame et lamelle en immersion. Cette technique nécessite par contre un étalement très mince ce qui empêche la lamelle de coller à l’objectif permettant ainsi les déplacements de la préparation sur la platine. L’objectif 4x peut-être utile pour retrouver plus rapidement une plage de l’étalement.

Sur chaque objectif on retrouve des inscriptions qui le décrive. Dans l’exemple, le mot plan décrit le type d’objectif. Celui-ci est planachromatique c’est-à-dire achromatique avec planéité de l’image. Le terme Ph indique un objectif pour contraste de phase.

Les nombres 40/0,65 indiquent le grossissement « 40x » et l’ouverture numérique « 0,65 ». Le nombre 160 donne la longueur du tube du microscope et 0,17 est l’épaisseur des lamelles prévues pour cet objectif.

Les objectifs à immersion ont un anneau coloré près de la lentille frontale. La couleur de cet anneau indique le type de liquide à immersion à utiliser. Un cercle noir est pour l’huile tandis que l’anneau orange est pour la glycérine.

L’ouverture numérique

L’ouverture numérique d’un objectif est le produit de l’indice de réfraction du milieu entre la lentille frontale et la lamelle par le sinus de la moitié de l’angle d’ouverture. (O.N. = n * sin (theta;/2).

Le grossissement maximum avec une image nette peut difficilement dépasser 500 fois l’ouverture numérique. Au-delà de cette limite, on peut voir des artefacts créés par des images de diffraction. L’air a un indice de 1,0 tandis que l’huile à immersion a un indice 1,515, l’huile permet donc des grossissements 1,5 fois plus grands.

L’entretien des objectifs

La principale manifestation d’un objectif sale ou rayé est une diminution de la netteté de l’image. Dans cette condition, le champ microscopique est vu avec une impression de brouillard. Il existe dans le commerce des solutions spécialement conçues pour le nettoyage des objectifs. Il faut cependant essuyer rapidement et complètement le liquide de nettoyage car, ces solutions peuvent à la longue endommager le ciment qui retient la lentille frontale. Certains utilisent un mélange éthanol/éther (50/50) qui a l’avantage de sécher très rapidement. Les rayures de la lentille frontale sont sans solution autre que le remplacement. Une cause fréquente et souvent ignorée de rayure est le frottement de la lentille sur le levier du porte-lame ( celui-ci est en général plus épais que la lame). Il faut donc éviter de travailler aux limites du déplacement.

Le condensateur

La fonction du condensateur est de concentrer la lumière sur l’objet. Le champ éclairé par le condensateur doit être uniforme. La position normale du condensateur est presque complètement en haut avec la lentille frontale du condensateur très près de la lame. Nous verrons plus loin comment ajuster le condensateur à sa position optimale. Certains condensateurs possèdent une lentille frontale escamotable. Cette particularité est utile pour l’examen à faible grossissement. Basculer la lentille frontale, permet un éclairage plus uniforme aux 2,5x et 10x.

Dans chaque condensateur il y a un diaphragme. Le rôle de ce diaphragme est de sélectionner les rayons lumineux qui vont passer au centre de la lentille collectrice. L’iris du condensateur n’est surtout pas pour ajuster la luminosité on se sert du rhéostat de la lampe pour cet ajustement. La fermeture de l’iris augmente la profondeur de champ et le contraste mais diminue la résolution et la luminosité. Un iris trop fermé peut aussi donner des images fantômes.

Le pouvoir séparateur limite du microscope, est donné par la formule

O.N. est l’ouverture numérique, lamda est la longueur d’onde, d est le pouvoir séparateur c’est à dire la plus petite distance entre deux éléments qui permet une distinction.

Ajustement de l’iris du condensateur

La position idéale de l’iris du condensateur est lorsqu’il est ouvert de 70 à 80% de l’ouverture numérique de l’objectif. Cet ajustement se fait en retirant l’oculaire et en regardant par le tube le diamètre du champ qui est éclairé.

Le centrage du condensateur

Cette opération se fait en cinq étapes: Enlever le filtre diffuseur du chemin optique. Placer une lame sur le microscope et faire la mise au point. Fermer complètement l’iris de champ. Centrer à l’aide des vis de centrage. Replacer le filtre diffuseur.

Ajustement de l’éclairage de Kohler.

La zone éclairée par le diaphragme de champ doit correspondre au champ observé. Une zone éclairée plus grande que le champ observé provoque une diminution du contraste.

Cette opération se fait en plusieurs étapes:

1. Enlever le filtre diffuseur du chemin optique.
2. Placer une lame sur le microscope et faire la mise au point.
3. Fermer complètement l’iris de champ.
4. Descendre ou monter le condensateur pour que l'image de l'hexagone soit nette.
5. Centrer si nécessaire à l’aide des vis de centrage.
6. Ouvrir le diaphragme de champ pour que les sommets du polygone touchent à la limite du champ.

   

7. Replacer le filtre diffuseur.

Microscopie en lumière polarisée

La lumière polarisée

Un rayon lumineux d’une lampe halogène est constitué d’une infinité d’ondes. Chacune de ces ondes est caractérisée par une direction de propagation et une vibration, de longueur d’onde lambda, perpendiculaire à la direction. Normalement la vibration des ondes se fait dans toutes les directions avec égale intensité de sorte que la lumière est dite non polarisée.

Certaines substances, douées de ce que l’on appelle dichroïsme, sont capables de favoriser un plan de vibration de sorte que les ondes de la lumière émergente vibrent toutes dans le même plan. On dit que cette lumière est polarisée. La sélection des ondes dans un polariseur se fait en éliminant celles qui vibrent dans la mauvaise direction soit par: réflexion, réfraction, transmission, dispersion.

Il y a plusieurs façons d’obtenir une source de lumière polarisée. La façon la plus simple et économique est d’utiliser un filtre polaroide. Celui-ci est formé de molécules toutes orientées dans la même direction et figées dans une matrice plastique. Ce polaroide est disponible en feuille que l’on peut découper à la taille et à la forme voulue. Un polariseur laisse passer seulement la lumière qui vibre dans une direction donc, tous les rayons émergents vibrent dans le même plan. Si je place dans le chemin du rayon polarisé un deuxième filtre polarisant que je tourne pour que son plan de vibration soit orienté à 90° par rapport au premier il n’y aura alors pas de lumière émergente du deuxième filtre. On dit alors que les filtres sont en situation croisée. Dans cet arrangement le premier filtre est le filtre polariseur et le deuxième est appelé l’analyseur.

Certaines substances comme les sucres sont capables de faire tourner le plan de la lumière polarisée. Si je place une solution de sucre entre les filtres croisés d’un polarimètre je devrai tourner l’analyseur d’un certain angle soit à droite (d) soit à gauche (l) pour obtenir de nouveau l’extinction de la lumière.

La microscopie en lumière polarisée

Pour faire de la microscopie en lumière polarisée il faut donc deux filtres polariseurs. Le premier filtre est placé dans la tête du microscope et le deuxième est placé avant le condensateur soit dans le porte-filtre ou sur l’ouverture de la lampe. Ce dernier filtre est tourné pour obtenir l’extinction complète de la lumière. Cette configuration permet ainsi l’examen d’éléments capables d’influencer le plan de la lumière polarisée les rendant ainsi visibles dans un fond noir.

Les éléments du sédiment urinaire visibles en lumière polarisée ont tous une structure cristalline (cristaux, cristaux liquides).

Biréfringence

Un rayon lumineux qui passe d’une phase à une autre avec un certain angle par rapport à la normale subit une déviation appelée réfraction. Avec un corps transparent on peut décrire une propriété physique appelée indice de réfraction. L’indice de réfraction est le rapport entre la vitesse de la lumière dans le vide et la vitesse de la lumière dans l’objet. Pour l’air, ce rapport est très proche de 1,0 tandis que l’eau à un indice de 1,333. L’indice de réfraction d’une solution aqueuse varie avec la densité.

Dans un corps isotrope l’indice de réfraction est unique quel que soit la direction mais avec certaines substances dites anisotropes l’indice de réfraction n’est pas le même dans toutes les directions. Plusieurs cristaux sont anisotropes c’est à dire biréfringents. La manifestation la plus évidente de la double réfringence est le dédoublement d’une image vue au travers un cristal de calcite. Les deux rayons qui sortent d’un corps anisotrope sont appelés le rayon ordinaire et le rayon extraordinaire. Le rayon ordinaire et extraordinaire sont polarisés avec un plan de polarisation qui est normalement à 90° l’un par rapport à l’autre. Entre des polariseurs croisés le cristal biréfringent est visible.

Utilité

L’examen microscopique en lumière polarisée est une nécessité pour l’identification des corps ovalaires graisseux. Ceux-ci contiennent des gouttelettes de gras contenant des cristaux liquides de cholestérol qui prennent une apparence de croix de Malte en lumière polarisée.

La polarisation peut être aussi utile pour identifier certains cristaux. La biréfringence, forte ou faible avec ou sans dispersion chromatique, est une aide supplémentaire à l’identification.

Il est possible de mesurer l’indice de réfraction d’un cristal avec la lumière polarisée. Les mesures se font en utilisant un filtre jaune proche de la raie D du sodium. Lorsqu’un cristal isotrope est placé dans un milieu qui a un indice de réfraction différent, il se forme autour du cristal un halo appelé ligne de Becke. Lorsqu’on descend l’objectif, ce halo converge vers le cristal si l’indice de réfraction de celui-ci est inférieur au milieu. À l’inverse, si le cristal a un indice supérieur au milieu, le halo s’éloigne du cristal. Il existe des kits de milieu qui offrent un éventail d’indices de réfraction qui s’échelonnent de 1,40 à 2,00. Lorsque le milieu a le même indice que le cristal celui-ci perd l’effet de halo et devient peu visible.

Le contraste de phase

Principe

La microscopie en lumière ordinaire nous montre les différences de teintes de gris (de couleur) entre un objet et son milieu. Un objet incolore et transparent d’indice de réfraction n et d’épaisseur e dans un milieu incolore et transparent d’indice de réfraction n est à peu près invisible sauf si le bord de l’objet produit une diffraction importante. Dans ces conditions, un rayon lumineux qui traverse l’objet suit un chemin différent de celui qui traverse uniquement le milieu on dit alors que l’objet à une différence de phase.

Cette différence de phase s’exprime par l’équation:

La différence de phase psi est:

• proportionnelle à la différence de chemin optique delta; e(n-n')
• inversement proportionnelle à la longueur d’onde lambda;

La microscopie en contraste de phase est un système optique qui transforme la différence de phase en intensité de gris permettant ainsi de voir des objets autrement invisibles. Le système optique est composé de deux anneaux dits de phase. Un de ces anneaux est placé dans l’objectif tandis que l’autre est dans le condensateur. Le diamètre des anneaux varie avec le grossissement de sorte que le condensateur à contraste de phase a plusieurs anneaux qui correspondent aux différents objectifs PH.

Les éléments de la microscopie urinaire qui profitent le plus du contraste de phase sont les cylindres hyalins spécialement ceux de type « Early ». Le contraste de phase permet aussi de distinguer les noyaux des cellules, en autant que celles-ci ne soient pas trop vacuolées. Le contraste de phase est d’une utilité limitée avec les sédiments chargés « sales » ou ceux avec une cristallurie importante. Lorsqu’un élément a une différence de phase importante, il se produit autour de l’élément un halo qui nuit à la lecture du sédiment.

Ajustement des anneaux de phase

Pour que l’image obtenue soit optimum il faut ajuster la convergence des anneaux. L’opération est relativement simple.

1. Sélectionner un objectif PH de faible grossissement.
2. Sélectionner l’anneau de condensateur spécifique.
3. Retirer un des oculaires et le remplacer par le télescope d’ajustement.
4. Ajuster le télescope pour avoir une image nette de l’anneau de l’objectif.
5. Avec les vis d’ajustement du condensateur superposer les anneaux.

   

6. Remettre l’oculaire en place.

Il n'est normalement pas nécessaire d’ajuster tous les objectifs.